Non-tissue-specific alkaline phosphatase. Study of functional properties on intestinal barrier function and inflammation.
URI: https://hdl.handle.net/10481/88328
Mireia Tena Garitaonaindia
Abstract
INTRODUCTION: Alkaline phosphatases (APs) are homodimeric glycoproteins (EC. 3.1.3.1) widely distributed in numerous species that catalyse the hydrolysis of phosphate groups at alkaline pH, releasing inorganic phosphate and an alcohol group. They can dephosphorylate a wide variety of molecules, such as nucleotides, bacterial lipopolysaccharides (LPS) or inorganic pyrophosphate (PPi). In humans, there are four AP isoenzymes, including tissue-specific forms: intestinal alkaline phosphatase (IAP, encoded by the ALPI gene), placental (PLAP, encoded by ALPP), and germline (GCAP, encoded by ALPPL2), along with non-tissue-specific alkaline phosphatase (TNAP), encoded by the ALPL gene. TNAP has several isoforms that differ in glycosylation and sensitivity to inhibitors that are named after the tissue where they are mainly expressed: liver, bone and kidney (1)
TNAP plays a crucial role in bone mineralisation by hydrolysing inorganic pyrophosphate, facilitating skeletal and dental mineralisation (2). It is also involved in purinergic signalling, acting as an ectonucleotidase to hydrolyse extracellular ATP to adenosine (3). Recent research has highlighted the importance of TNAP in liver metabolism (4), thermogenesis (5) and the maintenance of immune system cells (6,7). Choline, a substrate of TNAP, may link TNAP activity to liver metabolism (8). This isoform of alkaline phosphatase is also expressed in the intestine, specifically in lamina propria leukocytes and intestinal epithelial cells (IECs) (9).
Among alkaline phosphatases, IAP is well characterised and is involved in lipid absorption (10,11), bicarbonate secretion (12,13), attenuation of LPS-mediated inflammation (14-17) and dephosphorylation of nucleotides and other inflammatory molecules (18,19).
Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the main hepatic manifestation of the metabolic syndrome and the most common chronic liver disease in Western countries, with an overall prevalence of approximately 25% in the adult population, especially in people with obesity and diabetes. NAFLD is characterised by hepatic steatosis (accumulation of triglycerides in hepatocytes) in the presence of metabolic risk factors (particularly obesity and type 2 diabetes) and in the absence of excessive alcohol consumption (30g/day for men and 20g/day for women) or other chronic liver diseases (20 -22). Multiple factors, such as insulin resistance, microbiota, genetics and environmental factors, contribute to NAFLD. Intestinal barrier function may also play a role in the pathogenesis of NAFLD, with increased bacterial permeability potentially contributing to hepatic and extrahepatic damage (23 -29). The actions of TNAP, including dephosphorylation of proinflammatory molecules and maintenance of intestinal permeability, may affect susceptibility to NAFLD.
Inflammatory bowel disease (IBD) includes Crohn’s disease and ulcerative colitis, characterised by chronic inflammation and immune dysfunction. IBD patients require prolonged medical and surgical interventions that affect their quality of life. The exact causes of IBD are still unclear, but involve an altered intestinal mucosal immune system in genetically susceptible individuals. TNAP (30). Induction of TNAP has been observed in inflamed intestines (31), but its role in IBD is limitedly understood.
Therefore, this PhD Thesis aims to elucidate the role of TNAP in NAFLD and in the intestinal epithelium under basal and inflamed conditions.
OBJECTIVES: The overall objective of this PhD thesis is to elucidate the role of TNAP in hepatic and intestinal pathophysiology. To study the involvement of NPAT in the development of dietary lipid-mediated hepatic steatosis.
- To study the role of intestinal epithelial NAPT under basal conditions.
- To study the role of intestinal epithelial NAPT in DSS-induced experimental colitis.
MATERIALS AND METHODS: To carry out the aims of the thesis, in vivo, ex vivo and in vitro experiments were performed using a wide variety of techniques or procedures, including steatosis model diets, dextran sulphate sodium sulphate (DSS)-induced colitis, real-time quantitative PCR, multiplex, histology and western blot techniques.
Mice haplodeficient for TNAP (TNAP+/-) and mice with a conditional deletion of the TNAP intestinal epithelium (AlplIEC-/-) were used to elucidate the role of TNAP in steatosis and intestinal barrier integrity. The latter were obtained in our laboratory for this thesis.
RESULTS AND DISCUSSION: Our results can be divided into three sections.
(1) Role of TNAP in non-alcoholic fatty liver disease through the methionine and choline deficient diet (MCD) model.
WT and haplodeficient animals were fed a control diet or a methionine and choline deficient diet (MCD) for 17 days. Ethical considerations led to termination of the experiment due to severe weight loss observed in mice fed the MCD diet. Mice fed the MCD diet showed signs typical of this animal model, including elevated alanine aminotransferase (ALT) activity and decreased blood glucose levels, with no discernible differences between genotypes. The characteristic accumulation of liver fat was also confirmed. Interestingly, haplodeficient mice on the control diet showed microsteatosis and increased hepatic fat content compared to mice fed the normal diet (4%, w:w), implicating TNAP in high-fat diet-induced steatosis. Notably, the fat and sucrose content of the control diet in this experiment was higher than that of a normal diet.
In addition, genotype influenced alterations in several plasma parameters when mice were fed the control diet. TNAP mice exhibited higher levels of IL-6, pancreatic peptide, resistin and glucagon in plasma. Notably, there was increased expression of fibrosis genes (Des and Tgfb1, the latter not statistically significant) in the liver of haplodeficient mice fed the control diet, along with higher levels of Il1b and Tnf genes (p=0.08). In addition, haplodeficiency combined with the control diet induced changes in genes related to carbohydrate, fatty acid and bile acid metabolism. All these results suggest that TNAP may be involved in the development of the steatosis phenotype associated with high-fat diets.
(2) Impact of Alpl deletion on intestinal epithelial cells in mice.
To determine the role of TNAP in the intestinal epithelium, WT and AlplIEC-/- mice were sacrificed 7 days after the first injection of tamoxifen. Using Alpl_flox primers, gene silencing was confirmed in colonic and small intestinal epithelial cells (IEC). The resulting phenotype after Alpl deletion in the intestinal epithelium was apparently normal. At the intestinal level, no histological differences were observed. Alkaline phosphatase activity remained unchanged in all intestinal segments (jejunum, ileum, colon); however, notable changes in in vitro sensitivity to levamisole and TNAP inhibitor were observed. The absence of Alpl in IECs induced modifications in the expression of intestinal isoforms. Specifically, in the small intestine, a decrease in Akp3 and Akp6 expression was observed, while the opposite was observed in the colon (although not statistically significant). These genes encode IAP isoforms in the mouse intestine. Akp3 is specifically expressed in the duodenum, while Akp6 is expressed at high levels throughout the gastrointestinal tract.
In assessing possible extraintestinal effects, increased AP activity was identified in bone and kidney of AlplIEC-/- mice, with no alterations in inhibitor sensitivity. Alpl deletion in IECs resulted in up-regulation of fibrosis and inflammation genes in the liver (Tgfb1, Des, Tnf). In addition, increased expression of Nt5e (linked to the purinergic system) and Tff3 (associated with liver metabolism) was detected. In line with this, knockout mice showed reduced levels of choline and phosphocholine (not significant for the latter), possibly related to a reduced capacity for dephosphorylation and thus choline uptake, resulting in a choline deficit in the liver. Taken together, these findings underline the importance of intestinal NAPT not only within the gut itself, but also systemically.
(3) Role of intestinal epithelial Alpl in experimental colitis.
WT and AlplIEC-/- mice were exposed to 2.5% (w:v) DSS for 7 days after inducing Alpl gene deletion by tamoxifen administration. DSS-induced colitis resulted in greater weight loss in knockout mice and a higher disease activity index (DAI) in early stages of the disease. There were no differences between genotypes in colon length or thickness in this experimental colitis model. Histologically, AlplIEC-/- mice with colitis showed increased submucosal infiltration. Macroscopic results indicated a worse condition in AlplIEC-/- mice during colitis. However, biochemical analysis of the colon revealed that these mice had a lower degree of inflammation, as evidenced by reduced inflammatory markers. The protective effect is evident after 4 days and is not associated with changes in the expression of other alkaline phosphatase isoforms, but is attributed to the early increase in enzyme activity within the colon.
CONCLUSIONS. The conclusions are:
- Alpl gene haplodeficiency (TNAP+/- mice) associated with a high fat diet (10% w/w) induces a steatogenic response similar to that observed in WT animals fed a fat diet deficient in choline and methionine, with an increase in certain inflammatory and fibrosis parameters, and modulation of certain genes related to bile acid metabolism. Thus, TNAP is involved in the adaptive response to fat.
- Deletion of Alpl in the intestinal epithelium affected small and large intestinal cells, without producing discernible morphological or molecular changes in both segments, nor substantial alterations in the microbiota. The deletion induced changes in the expression of certain genes, such as Akp3, Akp6, Tjp1, Cxcl1 or Cxcl10, in primary epithelial cells and jejunal organoids, although the nature of these changes was not consistent in these cell populations, presumably due to differences in the biological context, such as the presence or absence of microbiota and non-epithelial cells.
- Intestinal epithelial deletion of Alpl alters extraintestinal AP activity under basal conditions, increasing it in bone and kidney, with no change in sensitivity to specific inhibitors, so the pattern of glycosylation does not appear to be modified in these tissues.
- Intestinal epithelial deletion of Alpl increases the expression of genes related to liver fibrosis and inflammation, and modulates the expression of genes related to lipid metabolism in the liver. These changes are associated with choline deficiency in the liver. Thus, deficiency of TNAP activity in the intestinal epithelium results in reduced delivery of this important metabolite to the liver, probably contributing to the establishment of a proinflammatory and profibrotic phenotype, and presumably to alterations in lipid metabolism. Long-term experiments will be necessary to confirm this.
- Epithelial deletion of Alpl results in a complex phenotype in DSS-induced experimental colitis, combining increased macroscopic and neutrophilic infiltration impairment and attenuated expression of inflammatory markers in the colon, which seems to reflect a lower state of activation of the mucosal infiltrate. Protection is exerted as early as 4 days, and is not related to modulation of the expression of other alkaline phosphatase isoforms, but to the early increase of enzyme activity in the colon.
- The results obtained in this PhD thesis confirm that intestinal epithelial NAPT is biologically relevant in both intestinal and extraintestinal tissues. Therefore, NAPT continues to emerge as a key player in intestinal barrier function.
Resumen
INTRODUCCIÓN: Las fosfatasas alcalinas (APs) son glicoproteínas homodiméricas (EC. 3.1.3.1) ampliamente distribuidas en numerosas especies que catalizan la hidrólisis de grupos fosfato a pH alcalino, liberando fosfato inorgánico y un grupo alcohol. Pueden desfosforilar una amplia variedad de moléculas, como nucleótidos, lipopolisacáridos bacterianos (LPS) o pirofosfato inorgánico (PPi). En los humanos, existen cuatro isoenzimas de AP, incluyendo formas específicas de tejido: la fosfatasa alcalina intestinal (IAP, codificada por el gen ALPI), la placentaria (PLAP, codificada por ALPP), y la germinal (GCAP, codificada por ALPPL2), junto con la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP), codificada por el gen ALPL. TNAP tiene varias isoformas que difieren en la glicosilación y la sensibilidad a inhibidores que reciben el nombre del tejido donde se expresan principalmente: el hígado, el hueso y el riñón (1).
TNAP desempeña un papel crucial en la mineralización ósea al hidrolizar el pirofosfato inorgánico, facilitando la mineralización esquelética y dental (2). También está involucrada en la señalización purinérgica, actuando como una ectonucleotidasa para hidrolizar el ATP extracelular a adenosina (3). Investigaciones recientes han resaltado la importancia de TNAP en el metabolismo hepático (4), la termogénesis (5) y el mantenimiento de las células del sistema inmunológico (6,7). La colina, un sustrato de TNAP, podría vincular la actividad de TNAP con el metabolismo hepático (8). Esta isoforma de la fosfatasa alcalina también se expresa en el intestino, específicamente en los leucocitos de la lámina propia y en las células epiteliales intestinales (IECs) (9).
Entre las fosfatasas alcalinas, la IAP está bien caracterizada y está involucrada en la absorción de lípidos (10,11), la secreción de bicarbonato (12,13), la atenuación de la inflamación mediada por LPS (14-17) y la desfosforilación de nucleótidos y otras moléculas inflamatorias (18,19).
La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la principal manifestación hepática del síndrome metabólico y la enfermedad hepática crónica más frecuente en los países occidentales, con una prevalencia general de aproximadamente el 25% en la población adulta, especialmente en personas con obesidad y diabetes. La NAFLD se caracteriza por esteatosis hepática (acumulación de triglicéridos en los hepatocitos) en presencia de factores de riesgo metabólicos (particularmente obesidad y diabetes tipo 2) y en ausencia de un consumo excesivo de alcohol ( 30g/día para hombres y 20g/día para mujeres) u otras enfermedades hepáticas crónicas (20 -22). Múltiples factores, como la resistencia a la insulina, la microbiota, la genética y factores ambientales, contribuyen a la NAFLD. La función de barrera intestinal también puede desempeñar un papel en la patogénesis de la NAFLD, con un aumento de la permeabilidad bacteriana que podría contribuir al daño hepático y extrahepático (23 -29). Las acciones de TNAP, incluida la desfosforilación de moléculas proinflamatorias y el mantenimiento de la permeabilidad intestinal, pueden afectar a la susceptibilidad a la NAFLD.
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) comprende la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, caracterizadas por la inflamación crónica y la disfunción inmunológica. Los pacientes con EII requieren intervenciones médicas y quirúrgicas prolongadas que afectan su calidad de vida. Las causas exactas de la EII aún no están claras, pero involucran un sistema inmunológico de la mucosa intestinal alterado en individuos genéticamente susceptibles. TNAP (30). Se ha observado una inducción de TNAP en intestinos inflamados (31), pero su papel en la EII se comprende de manera limitada.
Por lo tanto, esta Tesis Doctoral tiene como objetivo elucidar el papel de TNAP en la NAFLD y en el epitelio intestinal en condiciones basales e inflamadas.
OBJETIVOS: El objetivo general de esta tesis doctoral es esclarecer el papel de la TNAP en la fisiopatología hepática e intestinal. Basándonos en lo mencionado en la introducción, los objetivos concretos de la tesis doctoral son los siguientes: 1. Estudiar la implicación de la TNAP en el desarrollo de esteatosis hepática mediada por lípidos de la dieta.
2. Estudiar el papel de la TNAP epitelial intestinal en condiciones basales.
3. Estudiar el papel de la TNAP epitelial intestinal en la colitis experimental inducida por DSS.
MATERIAL Y MÉTODOS: Para llevar a cabo los objetivos de la Tesis, se realizaron experimentos in vivo, ex vivo e in vitro utilizando una amplia variedad de técnicas o procedimientos, que incluyeron dietas modelo de esteatosis, colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS), PCR cuantitativa en tiempo real, multiplex, técnicas de histología y western blot.
Se utilizaron ratones haplodeficientes para TNAP (TNAP+/-) y ratones con una deleciónn condicional del epitelio intestinal de TNAP (AlplIEC-/-) para aclarar el papel de TNAP en la esteatosis y en la integridad de la barrera intestinal. Estos últimos fueron obtenidos en nuestro laboratorio para llevar a cabo esta Tesis.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Nuestros resultados se pueden dividir en tres secciones.
(1) Papel de TNAP en la enfermedad del hígado graso no alcohólico a través del modelo de dieta deficiente en metionina y colina (MCD).
Animales WT y haplodeficientes fueron alimentados con una dieta control o una dieta deficiente en metionina y colina (MCD) durante 17 días. Consideraciones éticas llevaron a poner fin al experimento debido a la pérdida de peso severa observada en los ratones alimentados con la dieta MCD. Los ratones alimentados con la dieta MCD mostraron signos típicos de este modelo animal, incluida la elevación de la actividad de alanina aminotransferasa (ALT) y la disminución de los niveles de glucosa en sangre, sin diferencias discernibles entre los genotipos. También se confirmó la acumulación característica de grasa hepática. Curiosamente, los ratones haplodeficientes con la dieta control mostraron microesteatosis y un mayor contenido de grasa hepática en comparación con los ratones alimentados con dieta normal (4%, p:p), implicando a TNAP en la esteatosis inducida por una dieta rica en grasas. Cabe destacar que el contenido de grasa y sacarosa en la dieta control de este experimento fue más alto que el de una dieta normal.
Además, el genotipo influyó en las alteraciones en varios parámetros plasmáticos cuando los ratones fueron alimentados con la dieta control. Los ratones TNAP exhibieron niveles más altos de IL-6, péptido pancreático, resistina y glucagón en plasma. Notablemente, hubo un aumento en la expresión de genes de fibrosis (Des y Tgfb1, este último sin significación estadística) en el hígado de los ratones haplodeficientes con la dieta control, junto con niveles más altos de genes Il1b y Tnf (p=0,08). Además, la haplodeficiencia combinada con la dieta control indujo cambios en genes relacionados con el metabolismo de carbohidratos, ácidos grasos y ácidos biliares. Todos estos resultados sugieren que la TNAP puede estar involucrada en el desarrollo del fenotipo de esteatosis asociado a dietas altas en grasas.
(2) Consecuencia de la eliminación de Alpl en las células epiteliales intestinales en ratones.
Para determinar el papel de la TNAP en el epitelio intestinal, los ratones WT y AlplIEC-/- fueron sacrificados 7 días después de la primera inyección de tamoxifeno. Mediante el uso de cebadores Alpl_flox, se confirmó el silenciamiento del gen en las células epiteliales intestinales (IEC) colónicas y de intestino delgado. El fenotipo resultante después de la eliminación de Alpl en el epitelio intestinal fue aparentemente normal. A nivel intestinal, no se observaron diferencias histológicas. La actividad de la fosfatasa alcalina permaneció sin cambios en todos los segmentos intestinales (yeyuno, íleon, colon); sin embargo, se observaron cambios notables en la sensibilidad in vitro al levamisol y al inhibidor de TNAP. La ausencia de Alpl en las IEC indujo modificaciones en la expresión de isoformas intestinales. Específicamente, en el intestino delgado, se observó una disminución en la expresión de Akp3 y Akp6, mientras que se observó lo contrario en el colon (aunque no fue estadísticamente significativo). Estos genes codifican isoformas de IAP en el intestino de los ratones. Akp3 se expresa específicamente en el duodeno, mientras que Akp6 se expresa en niveles altos en todo el tracto gastrointestinal.
Al evaluar los posibles efectos extraintestinales, se identificó una mayor actividad de AP en hueso y riñón de los ratones AlplIEC-/-, sin alteraciones en la sensibilidad a los inhibidores. La eliminación de Alpl en las IEC resultó en una regulación al alza de genes de fibrosis e inflamación en el hígado (Tgfb1, Des, Tnf). Además, se detectó un aumento en la expresión de Nt5e (vinculado al sistema purinérgico) y Tff3 (asociado al metabolismo hepático). En línea con esto, los ratones knockout mostraron niveles reducidos de colina y fosfocolina (no significativos para este último), posiblemente relacionados con una menor capacidad de desfosforilación y, por tanto, absorción de colina, resultando en un déficit de colina en el hígado. En conjunto, estos hallazgos subrayan la importancia de la TNAP intestinal no solo dentro del intestino en sí, sino también de manera sistémica.
(3) Papel de Alpl epitelial intestinal en la colitis experimental.
Los ratones WT y AlplIEC-/- fueron expuestos a DSS al 2.5% (p:v) durante 7 días después de inducir la eliminación del gen Alpl mediante la administración de tamoxifeno. La colitis inducida por DSS resultó en una mayor pérdida de peso en los ratones knockout y un mayor índice de actividad de la enfermedad (DAI) en las etapas tempranas de la enfermedad. No hubo diferencias entre los genotipos en longitud o grosor del colon en este modelo de colitis experimental. Histológicamente, los ratones AlplIEC-/- con colitis mostraron un aumento en la infiltración submucosa. Los resultados macroscópicos indicaron un peor estado en los ratones AlplIEC-/- durante la colitis. Sin embargo, el análisis bioquímico del colon reveló que estos ratones tenían un menor grado de inflamación, como se evidenció por la reducción de los marcadores inflamatorios. El efecto protector se hace evidente a partir de los 4 días y no está asociado a cambios en la expresión de otras isoformas de fosfatasa alcalina, sino que se atribuye al aumento temprano en la actividad enzimática dentro del colon.
CONCLUSIONES: Las conclusiones son:
1. La haplodeficiencia del gen Alpl (ratones TNAP+/-) asociada con una dieta rica en grasa (10% p/p) induce una respuesta esteatogénica similar a la observada en animales WT alimentados con una dieta grasa deficiente en colina y metionina, con un aumento de ciertos parámetros inflamatorios y de fibrosis, y modulación de ciertos genes relacionados con el metabolismo de los ácidos biliares. Por tanto, la TNAP está implicada en la respuesta adaptativa a la grasa.
2. La deleción de Alpl en el epitelio intestinal afectó a células de intestino delgado y grueso, sin producir cambios discernibles morfológicos o moleculares en ambos segmentos, ni alteraciones sustanciales en la microbiota. La deleción indujo cambios en la expresión de ciertos genes, como Akp3, Akp6, Tjp1, Cxcl1 o Cxcl10, en células epiteliales primarias y en organoides yeyunales, si bien la naturaleza de tales cambios no fue consistente en estas poblaciones celulares, presumiblemente debido a las diferencias en el contexto biológico, como la presencia o ausencia de microbiota y células no epiteliales.
3. La deleción epitelial intestinal de Alpl altera la actividad AP extraintestinal en condiciones basales, aumentándola en hueso y riñón, sin cambios en la sensibilidad a inhibidores específicos, por lo que el patrón de glicosilación no parece verse modificado en estos tejidos.
4. La deleción epitelial intestinal de Alpl aumenta la expresión de genes relacionados con la fibrosis hepática e inflamación, y modula la expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico en el hígado. Estos cambios se asocian a un déficit de colina en el hígado. Por tanto, la deficiencia de actividad TNAP en el epitelio intestinal se traduce en un menor aporte de este importante metabolito al hígado, probablemente contribuyendo al establecimiento de un fenotipo proinflamatorio y profibrótico, y presumiblemente a alteraciones en el metabolismo de lípidos. Serán necesarios experimentos a largo plazo para confirmar este extremo.
5. La deleción epitelial de Alpl da lugar a un fenotipo complejo en la colitis experimental inducida por DSS, que combina un mayor deterioro en términos macroscópicos y de infiltración neutrofílica y una expresión atenuada de marcadores inflamatorios en el colon, que parece reflejar un menor estado de activación del infiltrado mucosal. La protección se ejerce ya a los 4 días, y no está relacionada con la modulación de la expresión de otras isoformas de fosfatasa alcalina, pero sí con el incremento temprano de actividad de la enzima en el colon.
6. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral confirman que la TNAP epitelial intestinal es biológicamente relevante tanto en los tejidos intestinales como en los extraintestinales. Por lo tanto, la TNAP sigue destacando como un elemento fundamental en la función de barrera intestinal.