Bioavailability and antihypertensive effect of quercetin
Pilar Galindo Gallardo
Resumen
En esta tesis doctoral se han desarrollado los siguientes puntos:
1) Determinar si existe una interacción entre la quercetina y la catequina con influencia en la prevención de la disfunción endotelial in vitro y los posibles mecanismos implicados.Para llevar a cabo este primer punto, hemos analizado las interacciones entre el flavonol quercetina y el flavan-3-ol (+)-catequina, dos de los flavonoides más abundantes en la dieta, sobre la función vascular a través del empleo de los dos compuestos puros y diferentes mezclas de estos dos flavonoides en proporción 1:0,1, 1:1 y 1:10. La quercetina indujo un efecto relajante dependiente de la concentración más potente que la catequina en la aorta aislada de rata, y el análisis isobolográfico de las mezclas no mostró efectos sinérgicos o antagónicos entre ellos, es decir, sus efectos son aditivos. La quercetina fue más potente en las arterias mesentéricas que en las pulmonares, mientras que la catequina tuvo efectos débiles en estos vasos y no modificó los efectos producidos por la quercetina. La disfunción endotelial basada únicamente en un incremento del estrés oxidativo, al impedir la degradación del anión superóxido (O2-) endógeno, mediante la inhibición de la superóxido dismutasa (SOD) con dietilditiocarbamato (DETCA), fue prevenido por la quercetina, mientras que la catequina mostró un efecto más débil y la mezcla 1:1 un efecto intermedio en comparación con los compuestos puros. La quercetina, pero no la catequina, mostró un efecto pro-oxidante y escavenger de óxido nítrico (NO), los cuales no fueron prevenidos por la presencia de catequina. En conclusión, la catequina fue menos potente que la quercetina como vasodilatador, pro-oxidante o previniendo la disfunción endotelial, y no existieron interacciones sinérgicas entre ambos flavonoides.
2) Analizar los efectos in vitro de los principales metabolitos conjugados de quercetina sobre el tono de las arterias de resistencia, así como determinar su patrón cinético en plasma tras su administración intravenosa y su correlación con el efecto in vivo sobre la presión arterial en ratas espontáneamente hipertensas (SHR, spontaneously hypertensive rat).El flavonoide quercetina, presente en la dieta, ejerce efectos cardiovasculares protectores. Debido a que la quercetina se metaboliza rápidamente en metabolitos glucuronizados menos activos o inactivos, y las concentraciones plasmáticas de quercetina libre son muy bajas, una enorme cantidad de datos científicos generados a lo largo de décadas con los compuestos conjugados in vitro han sido cuestionados. El objetivo en esta Tesis Doctoral fue determinar si el glucurónido de quercetina puede desconjugarse in situ y si esta desconjugación conduce a un efecto biológico. La quercetina y la quercetina 3-glucurónido (Q3GA) fueron perfundidos a través del lecho vascular mesentérico aislado de rata. La quercetina fue metabolizada rápidamente en el mesenterio. Sin embargo, la descomposición de la Q3GA fue más lenta y estuvo acompañada por un aumento progresivo de la cantidad de quercetina en el líquido perfundido y en el tejido durante las 6 horas del experimento, lo cual fue prevenido por el inhibidor selectivo de beta-glucuronidasas (SAL, saccharic acid 1,4-lactone o D-saccharolactone). La incubación de anillos de arterias mesentéricas, montados en un miógrafo de alambres, con la Q3GA durante 1 hora o más, resultó en una inhibición significativa de la respuesta contráctil que de nuevo fue impedido por el inhibidor SAL. Además, la administración intravenosa (iv) de Q3GA produjo un descenso lento, pero progresivo y sostenido de la presión arterial, lo que demuestra por primera vez que la Q3GA tiene efectos in vivo. Con este estudio concluimos que la Q3GA se comporta como un transportador de la quercetina en el plasma, la cual se desconjugaría in situ produciendo la liberación de la aglicona, que es la efectora final.Además se conoce que la administración oral crónica de quercetina reduce la presión arterial y restaura la disfunción endotelial en animales hipertensos. Sin embargo, la quercetina (aglicona) normalmente no está presente en el plasma, ya que se metaboliza rápidamente hacia metabolitos conjugados, la mayoría menos activos. El objetivo de este segundo estudio, dentro de este mismo punto, fue analizar si la desconjugación de estos metabolitos está implicada en el efecto hipotensor de la quercetina. Por ello, analizamos los efectos sobre la presión arterial y la función vascular in vitro de los metabolitos conjugados de quercetina (Q3GA; isorramnetina-3-glucurónido, I3GA, y quercetina-3¿-sulfato, Q3¿S) en SHR. La administración iv de los metabolitos Q3GA e I3GA (1 mg/kg), pero no la de Q3¿S, redujeron progresivamente la presión arterial media (PAM), determinada en SHR conscientes. El efecto hipotensor de Q3GA se suprimió en los animales hipertensos tratados previamente con el inhibidor específico de las beta-glucuronidasas (SAL, 10 mg/ml). En las arterias mesentéricas, a diferencia de la quercetina, la Q3GA no tuvo un efecto inhibitorio en la respuesta contráctil a fenilefrina después de 30 minutos de incubación. Sin embargo, después de 1 hora de incubación, la Q3GA reduce fuertemente esta respuesta, la cual fue prevenida por la incubación previa con el inhibidor SAL. La administración oral de quercetina (10 mg/kg) produjo una disminución progresiva de la PAM. También observamos que dicho efecto hipotensor desaparece en las SHR tratadas previamente con el SAL. Por tanto, podemos concluir que los metabolitos conjugados están implicados en el efecto antihipertensivo in vivo de quercetina, actuando como moléculas para el transporte plasmático de quercetina hacia los tejidos diana. La quercetina liberada desde sus metabolitos glucuronizados podría ser la responsable de su efecto vasorelajante e hipotensor.
3) Determinar si la pauta de administración de la quercetina (dosis única diaria, dosis dividida en dos tomas diarias o administrada por vía intraperitoneal (ip)) modifica el perfil de biodisponibilidad y el metabolismo en animales de experimentación y determinar la correlación entre el perfil farmacocinético y la actividad sobre la función endotelial y la presión arterial en animales hipertensos.Para llevar a cabo este objetivo empleamos SHR, las cuales fueron asignadas aleatoriamente a cuatro grupos experimentales: (1) 1 ml de metilcelulosa al 1% administrada por sonda oral y 2% de dimetilsulfóxido (DMSO) por vía ip (grupo control), (2) 10 mg/kg de quercetina administrada por sonda oral y 2% de DMSO administrada por vía ip, (3) 10 mg/kg de quercetina administrada por sonda oral dividida en dos dosis diarias (5+5 en intervalos de 12 horas) y 2% de DMSO administrada por vía ip, y (4) 1 ml de metilcelulosa al 1% administrada por sonda oral y 10mg/kg de quercetina administrada por vía ip. Las ratas se trataron diariamente durante 5 semanas. El tratamiento crónico oral con una y dos dosis diarias, fueron igualmente eficaces al final del mismo, tanto en la restauración de la vasodilatación dependiente del endotelio, previamente alterada, y en la reducción de la respuesta contráctil a fenilefrina en arterias mesentéricas, como en la reducción de la presión arterial sistólica, de la frecuencia cardíaca y de la hipertrofia cardíaca y renal. También se observó en los grupos tratados por vía oral, una disminución en la producción de O2- inducida por la nicotinamín adenín dinucleótido fosfato (NAD(P)H, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidasa vascular. La administración ip redujo, en menor medida que la administración oral, el aumento de la presión arterial sistólica, y no tuvo efectos sobre la disfunción endotelial y el estrés oxidativo vascular. Sin embargo, niveles más altos de metabolitos fueron cuantificados tras la administración ip en comparación con la oral, en cualquier tiempo estudiado, a excepción de los niveles plasmáticos de la aglicona de quercetina metilada que fue mayor en la administración oral en comparación con la administración ip a las 2 horas, pero no a las 8 horas. Así, podemos concluir que la quercetina administrada oralmente fue superior a la administrada ip, en cuanto a la protección frente a las complicaciones cardiovasculares en SHR. Pero no se encontraron diferencias entre la administración oral de una única dosis diaria o la dividida en dos tomas diarias.
Abstract
The following points have been developed in this doctoral thesis:
1) To determine whether there is an interaction between quercetin and catechin with an influence on the prevention of endothelial dysfunction in vitro and the possible mechanisms involved. To carry out this first point, we analysed the interactions between the flavonol quercetin and flavan-3-ol (+)-catechin, two of the most abundant flavonoids in the diet, on vascular function using the two pure compounds and different mixtures of these two flavonoids in a 1:0.1, 1:1 and 1:10 ratio. Quercetin induced a more potent concentration-dependent relaxant effect than catechin on isolated rat aorta, and isobolographic analysis of the mixtures showed no synergistic or antagonistic effects between them, i.e. their effects are additive. Quercetin was more potent in mesenteric arteries than in pulmonary arteries, while catechin had weak effects in these vessels and did not modify the effects produced by quercetin. Endothelial dysfunction based solely on increased oxidative stress by preventing endogenous superoxide anion (O2-) degradation through inhibition of superoxide dismutase (SOD) with diethyldithiocarbamate (DETCA) was prevented by quercetin, while catechin showed a weaker effect and the 1:1 mixture an intermediate effect compared to the pure compounds. Quercetin, but not catechin, showed a pro-oxidant and nitric oxide (NO) scavenger effect, which were not prevented by the presence of catechin. In conclusion, catechin was less potent than quercetin as a vasodilator, pro-oxidant or in preventing endothelial dysfunction, and there were no synergistic interactions between the two flavonoids.
2) To analyse the in vitro effects of the main quercetin conjugated metabolites on resistance artery tone and to determine their kinetic pattern in plasma after intravenous administration and their correlation with the in vivo effect on blood pressure in spontaneously hypertensive rats (SHR).The dietary flavonoid quercetin exerts cardiovascular protective effects. Because quercetin is rapidly metabolised to less active or inactive glucuronidated metabolites, and plasma concentrations of free quercetin are very low, an enormous amount of scientific data generated over decades with in vitro conjugated compounds have been questioned. The aim in this PhD thesis was to determine whether quercetin glucuronide can be deconjugated in situ and whether this deconjugation leads to a biological effect. Quercetin and quercetin 3-glucuronide (Q3GA) were perfused through the isolated rat mesenteric vascular bed. Quercetin was rapidly metabolised in the mesentery. However, the breakdown of Q3GA was slower and was accompanied by a progressive increase in the amount of quercetin in the perfused fluid and tissue during the 6 h of the experiment, which was prevented by the selective beta-glucuronidase inhibitor (SAL, saccharic acid 1,4-lactone or D-saccharolactone). Incubation of mesenteric artery rings, mounted on a wire myograph, with Q3GA for 1 hour or more resulted in a significant inhibition of the contractile response which was again prevented by the SAL inhibitor. In addition, intravenous (iv) administration of Q3GA produced a slow, but progressive and sustained decrease in blood pressure, demonstrating for the first time that Q3GA has in vivo effects. We conclude from this study that Q3GA behaves as a transporter of quercetin in plasma, which would deconjugate in situ leading to the release of the aglycone, which is the final effector, and that chronic oral administration of quercetin is known to lower blood pressure and restore endothelial dysfunction in hypertensive animals. However, quercetin (aglycone) is not normally present in plasma, as it is rapidly metabolised to conjugated metabolites, most of which are less active. The aim of this second study was to examine whether the deconjugation of these metabolites is involved in the hypotensive effect of quercetin. We therefore analysed the effects on blood pressure and vascular function in vitro of the conjugated metabolites of quercetin (Q3GA; isorramnetin-3-glucuronide, I3GA, and quercetin-3¿-sulphate, Q3¿S) in SHR. IV administration of Q3GA and I3GA metabolites (1 mg/kg), but not Q3¿S, progressively reduced mean arterial pressure (MAP), determined in conscious SHR. The hypotensive effect of Q3GA was abolished in hypertensive animals pretreated with the specific beta-glucuronidase inhibitor (SAL, 10 mg/ml). In mesenteric arteries, unlike quercetin, Q3GA had no inhibitory effect on the contractile response to phenylephrine after 30 min incubation. However, after 1 hour of incubation, Q3GA strongly reduced this response, which was prevented by prior incubation with the inhibitor SAL. Oral administration of quercetin (10 mg/kg) produced a progressive decrease in MAP. We also observed that this hypotensive effect disappeared in SHR pre-treated with SAL. We can therefore conclude that conjugated metabolites are involved in the in vivo antihypertensive effect of quercetin, acting as molecules for the plasma transport of quercetin to target tissues. Quercetin released from its glucuronidated metabolites could be responsible for its vasorelaxant and hypotensive effect.
3) To determine whether the pattern of quercetin administration (single daily dose, dose divided into two daily doses or administered intraperitoneally (ip)) modifies the bioavailability profile and metabolism in experimental animals and to determine the correlation between the pharmacokinetic profile and activity on endothelial function and blood pressure in hypertensive animals. To carry out this objective we employed SHR, which were randomly assigned to four experimental groups: (1) 1 ml of 1% methylcellulose administered by oral gavage and 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) by ip route (control group), (2) 10 mg/kg quercetin administered by oral gavage and 2% DMSO administered by ip route, (3) 10 mg/kg quercetin administered by oral gavage divided into two daily doses (5+5 at 12-hour intervals) and 2% DMSO administered ip, and (4) 1 ml of 1% methylcellulose administered by oral gavage and 10 mg/kg quercetin administered ip. Rats were treated daily for 5 weeks. Chronic oral once- and twice-daily treatment were equally effective at the end of treatment in restoring previously impaired endothelium-dependent vasodilation and reducing the contractile response to phenylephrine in mesenteric arteries, as well as reducing systolic blood pressure, heart rate and cardiac and renal hypertrophy. A decrease in vascular nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidase-induced O2- production was also observed in the orally treated groups. IP administration reduced, to a lesser extent than oral administration, the increase in systolic blood pressure, and had no effect on endothelial dysfunction and vascular oxidative stress. However, higher levels of metabolites were quantified after ip administration compared to oral administration, at any time studied, with the exception of plasma levels of methylated quercetin aglycone which was higher in oral administration compared to ip administration at 2 hours, but not at 8 hours. Thus, we can conclude that orally administered quercetin was superior to ip administration in terms of protection against cardiovascular complications in SHR. However, no differences were found between oral administration of a single daily dose or administration divided into two daily doses.