Efectos preventivos de quercetina sobre la disfunción endotelial.

Preventive effects of quercetin on endothelial dysfunction.

Manuel Sánchez Santos

Dpto. de Farmacología, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada.

Resumen

Numerosos estudios han hallado que el tratamiento crónico con el flavonoide de la dieta, quercetina, disminuye la presión arterial y restaura la disfunción endotelial en modelos de hipertensión animal.El primer objetivo de esta Tesis fue analizar los mecanismos relacionados con la mejora de la función endotelial en SHR a través de cambios en la expresión y actividad de la eNOS y NADPH oxidasa.Métodos: Machos SHR y WKY (de cinco semanas de edad) fueron tratados con quercetina (10mg/Kg) o vehículo (metil celulosa al 1% en agua) durante 13 semanas, diariamente, mediante sonda gastroesofágica. Cambios en la expresión vascular de la eNOS, Caveolina-1 y P47PHOX fueron analizados mediante western blot, la actividad de eNOS mediante la conversión de [3H]arginina a L-[3H]citrulina y la actividad de NADPH oxidasa mediante quimioluminiscencia con lucigenina.Resultados: En SHR, la quercetina redujo el incremento de la presión arterial (medida mediante pletismografía en la cola durante el tratamiento, y mediante registro directo en la arterial femoral una vez finalizado éste) y la frecuencia cardiaca, y aumentó la vasodilatación aórtica dependiente de endotelio inducida por acetilcolina, pero no tuvo efecto en la respuesta independiente de endotelio inducida por nitroprusiato sódico. Además, quercetina no tuvo tampoco efecto en la vasoconstricción dependiente de endotelio, ni la producción aórtica del vasoconstrictor tromboxano B2. Las SHR, comparadas con sus controles normotensos WKY, mostraron un aumento en la expresión proteica de eNOS y P47PHOX, una disminución de la expresión de la proteína inhibidora de eNOS, caveolina-1, y un aumento en la producción de superóxido inducida por NADPH pero, paradójicamente, la actividad de la eNOS se encontró que estaba disminuida. El tratamiento crónico con quercetina previno todos esos cambios en SHR. En WKY, quercetina no tuvo efecto en la presión arterial, la función endotelial, la expresión o actividad de las proteínas analizadas. Conclusiones: El tratamiento oral con quercetina resultó en un aumento de la actividad eNOS y disminuyó la generación de O2- mediada por NADPH oxidasa, asociado a una reducción en la expresión de P47PHOX, proporcionando una evidencia esencial para comprender cómo quercetina mejora la función endotelial y disminuye la presión arterial en la hipertensión.Debido al importante papel que desempeña angiotensina II (Ang II) en la patofisiología de la hipertensión y la disfunción endotelial en el modelo de hipertensión genética, SHR, quisimos ver si la mejora de la disfunción endotelial observada, se debió a la reducción de la presión arterial, a cambios neurohumorales o a efectos directos del flavonoide sobre la vasculatura. Por ello, nos propusimos un segundo objetivo en esta Tesis, estudiar los efectos de quercetina y su principal metabolito plasmático, isorhamnetina, en la disfunción endotelial aórtica inducida por Ang II y su relación con la actividad NAD(P)H oxidasa, mediante incubación in vitro con Ang II.Resultados: Hallamos que la incubación de anillos aórticos de ratas wistar kyoto (WKY) durante 6h horas con Ang II (10-6 M), producía disfunción endotelial en estos, ya que Ang II disminuyó la respuesta vasodilatadora a acetilcolina estos anillos aórticos precontraidos con fenilefrina. La coincubación con quercetina (10-5-10-6 M) o isorhamnetina (10-5-10-6 M), o la adición de superóxido dismutasa (SOD) o el inhibidor de la NAD(P)H oxidasa, apocinina, al medio de ensayo, previno este efecto. Tras 6 horas de incubación, Ang II produjo un importante aumento en la producción de O2-, tal como se determinó mediante la fluorescencia del dihidroetidio, lo que también se previno mediante la coincubación con quercetina o isorhamnetina. Ang II también aumentó la expresión de la subunidad reguladora P47phox de la NAD(P)H oxidasa. El análisis inmunohistoquímico reveló que esta sobre expresión de P47phox ocurría principalmente en la capa media del vaso, formada mayoritariamente por fibras de músculo liso vascular. Este aumento en la expresión de P47phox también fue prevenido mediante la coincubación con quercetina o isorhamnetina. Conclusiones: Estos datos muestran por primera vez, según nuestro conocimiento, que tanto quercetina como isorhamnetina previenen la disfunción endotelial aórtica inducida por Ang II, debido a la inhibición de la sobreexpresión de P47phox, y por tanto del consiguiente aumento en la producción de O2- por parte de la NAD(P)H oxidasa, lo que conduce a un aumento en la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO).%&/De esta forma se demuestra el importante papel de quercetina, el flavonol más abundante de la dieta, y su principal metabolito plasmático, isorhamnetina, en el papel protector de los flavonoides sobre las enfermedades cardiovasculares, tal como han demostrado numerosos estudios epidemiológicos.

Abstract

Numerous studies have found that chronic treatment with the dietary flavonoid quercetin lowers blood pressure and restores endothelial dysfunction in animal models of hypertension. The first aim of this thesis was to analyse the mechanisms related to the improvement of endothelial function in SHR through changes in eNOS and NADPH oxidase expression and activity.Methods: Male SHR and WKY (five weeks old) were treated with quercetin (10mg/kg) or vehicle (1% methyl cellulose in water) for 13 weeks, daily, via gastro-oesophageal tube. Changes in vascular expression of eNOS, Caveolin-1 and P47PHOX were analysed by western blot, eNOS activity by conversion of [3H]arginine to L-[3H]citrulline and NADPH oxidase activity by lucigenin chemiluminescence. Results: In SHR, quercetin reduced the increase in blood pressure (measured by tail plethysmography during treatment and by direct recording in the femoral artery after treatment) and heart rate, and increased acetylcholine-induced endothelium-dependent aortic vasodilatation, but had no effect on the endothelium-independent response induced by sodium nitroprusside. In addition, quercetin had no effect on endothelium-dependent vasoconstriction, nor aortic production of the vasoconstrictor thromboxane B2. SHRs, compared with their normotensive WKY controls, showed increased protein expression of eNOS and P47PHOX, decreased expression of the eNOS inhibitory protein caveolin-1, and increased NADPH-induced superoxide production but, paradoxically, eNOS activity was found to be decreased. Chronic quercetin treatment prevented all these changes in SHR. In WKY, quercetin had no effect on blood pressure, endothelial function, expression or activity of the proteins tested. Conclusions: Oral treatment with quercetin resulted in increased eNOS activity and decreased NADPH oxidase-mediated O2-mediated O2- generation, associated with a reduction in P47PHOX expression, providing essential evidence for understanding how quercetin improves endothelial function and lowers blood pressure in hypertension. Because of the important role of angiotensin II (Ang II) in the pathophysiology of hypertension and endothelial dysfunction in the genetic hypertension model, SHR, we wanted to see whether the observed improvement in endothelial dysfunction was due to blood pressure reduction, neurohumoral changes or direct effects of the flavonoid on the vasculature. We therefore set ourselves a second objective in this thesis, to study the effects of quercetin and its main plasma metabolite, isorhamnetin, on Ang II-induced aortic endothelial dysfunction and its relationship with NAD(P)H oxidase activity, by in vitro incubation with Ang II. Results: We found that incubation of aortic rings from wistar kyoto rats (WKY) for 6h with Ang II (10-6 M) produced endothelial dysfunction in these rats, as Ang II decreased the vasodilator response to acetylcholine in these aortic rings precontracted with phenylephrine. Co-incubation with quercetin (10-5-10-6 M) or isorhamnetin (10-5-10-6 M), or the addition of superoxide dismutase (SOD) or the NAD(P)H oxidase inhibitor apocynin to the test medium, prevented this effect. After 6 hours of incubation, Ang II produced a significant increase in O2- production, as determined by dihydroethidium fluorescence, which was also prevented by co-incubation with quercetin or isorhamnetin. Ang II also increased the expression of the P47phox regulatory subunit of NAD(P)H oxidase. Immunohistochemical analysis revealed that this overexpression of P47phox occurred mainly in the middle layer of the vessel, consisting mostly of vascular smooth muscle fibres. This increase in P47phox expression was also prevented by co-incubation with quercetin or isorhamnetin. Conclusions: These data show for the first time, to our knowledge, that both quercetin and isorhamnetin prevent Ang II-induced aortic endothelial dysfunction, due to inhibition of P47phox overexpression, and thus of the consequent increase in O2- production by NAD(P)H oxidase, leading to an increase in nitric oxide (NO) bioavailability. %&&/DThis demonstrates the important role of quercetin, the most abundant flavonol in the diet, and its main plasma metabolite, isorhamnetin, in the protective role of flavonoids in cardiovascular disease, as has been shown in numerous epidemiological studies.