Effect of alpha lipoic acid on embryonic development and oxidative status in the culture medium of bovine embryos in vitro
Fabra, M. (1)*; Anchordoquy, J.M. (1); Anchordoquy, J.P. (1); Carranza, A. (1); Furnus, C.(1); Nikoloff, N. (1)
(1) Instituto de Genética Veterinaria “Ing. Fernando N Dulout”, IGEVET (UNLP-CONICET-CONICET LA PLATA), Facultad de Ciencias Veterinarias – UNLP, Calle 60 118, B1904AMA La Plata, Buenos Aires, Argentina. *maricfabra@gmail.com
Resumen
El desarrollo embrionario preimplantacional in vitro en mamíferos consta de tres etapas consecutivas: maduración in vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV), y cultivo in vitro (CIV), influenciadas por distintos factores relacionados con las condiciones de cultivo y sus componentes. El sistema de producción de energía del embrión genera especies reactivas del oxígeno (ERO), controladas por un balance de estado óxido-reducción. Ante un desequilibrio, la producción de ERO puede aumentar ocasionando estrés oxidativo, provocando en el embrión daños como bloqueo embrionario, apoptosis y daño en el ADN. El ácido alfa lipoico (AAL), es un componente de las membranas celulares y tiene actividad antioxidante tanto in vivo como in vitro. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de AAL durante el CIV en el desarrollo embrionario temprano y el estatus oxidativo de embriones bovinos. Para ello se utilizaron ovocitos obtenidos a partir de ovarios de frigorífico que se sometieron a las etapas de MIV, FIV y CIV en una atmósfera gaseada con 5% CO2 a 39 °C y humedad a saturación, con 20% tensión de O2 durante el cultivo. El medio CIV fue suplementado con AAL: control, 5, 25 y 100µM AAL. Se obtuvieron un total de 212 embriones. Se evaluaron tasa de clivaje 48h post FIV, blastocistos al Día 7-8 (BL7-BL8) y hatching. Además, se evaluó la concentración de proteína, malondialehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), y GSH en BL8. El modelo estadístico incluyo las repeticiones (3-5) como efectos aleatorios de bloque y se evaluó el efecto fijo de cada variable comparando todos los tratamientos de cada experimento juntos. Las tasas de clivaje, BL y hatching se analizaron mediante regresión logística utilizando el procedimiento GENMOD (SAS Institute). La concentración de proteínas, contenido total de GSH, actividad SOD y MDA se analizaron mediante el procedimiento GLIMMIX (SAS Institute). La significancia estadística fue P<0,05. Nuestros resultados indicaron que las tasas de clivaje fueron mayores en el control y 5µM en comparación con el grupo 100µM (P=0.05). Las tasas de BL fueron similares en control y 5µM (P=0,1), pero disminuyeron en los grupos 25 y 100µM (P<0,01). Las tasas de hatching fueron mayores en los grupos control, 5µM y 25µM en comparación con el grupo 100µM (P<0.03). El contenido de proteína total y el estado oxidativo de los BL del tratamiento 100µl no se evaluaron debido al pequeño número obtenido. La concentración de proteína en los BL del grupo 5µM fue mayor que en los grupos control y 25µM (P<0.04). La concentración de GSH disminuyó en BL del grupo 5µM respecto al control (P=0,04). La actividad SOD y la concentración de MDA no difirió entre grupos (P>0,13). El tratamiento de 100µM fue perjudicial para el desarrollo embrionario. La disminución de GSH dada por 5µM podría deberse a que proporciona cisteína para la síntesis de proteínas embrionarias, efecto observado en el aumento de la concentración de proteína en los BL. El uso de 5µM AAL en el medio de CIV podría ser una buena estrategia para mejorar la calidad de los embriones bovinos.
Palabras clave: desarrollo embrionario, cultivo, bovinos
Abstract
Preimplantation in vitro embryo development in mammals consists of three consecutive stages: in vitro maturation (IVM), in vitro fertilisation (IVF), and in vitro culture (IVC), influenced by different factors related to culture conditions and their components. The embryo’s energy production system generates reactive oxygen species (ROS), controlled by an oxide-reduction state balance. In case of an imbalance, ROS production can increase causing oxidative stress, leading to embryonic damage such as embryonic blockage, apoptosis and DNA damage. Alpha lipoic acid (ALA) is a component of cell membranes and has antioxidant activity both in vivo and in vitro. The aim of this work was to study the effect of ALA during IVC on early embryonic development and oxidative status of bovine embryos. For this purpose, oocytes obtained from refrigerator ovaries were subjected to IVM, IVF and IVC stages in a gaseous atmosphere with 5% CO2 at 39 °C and humidity at saturation, with 20% O2 tension during culture. The IVC medium was supplemented with AAL: control, 5, 25 and 100µM AAL. A total of 212 embryos were obtained. Cleavage rate 48h post-IVF, blastocysts at Day 7-8 (BL7-BL8) and hatching were assessed. In addition, protein concentration, malondialehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), and GSH were assessed in BL8. The statistical model included replicates (3-5) as random block effects and the fixed effect of each variable was assessed by comparing all treatments in each experiment together. Rates of cleavage, BL and hatching were analysed by logistic regression using the GENMOD procedure (SAS Institute). Protein concentration, total GSH content, SOD activity and MDA were analysed using the GLIMMIX procedure (SAS Institute). Statistical significance was P<0.05. Our results indicated that cleavage rates were higher in control and 5µM compared to 100µM group (P=0.05). BL rates were similar in control and 5µM (P=0.1), but decreased in the 25 and 100µM groups (P<0.01). Hatching rates were higher in the control, 5µM and 25µM groups compared to the 100µM group (P<0.03). The total protein content and oxidative status of LAB from the 100µL treatment were not evaluated due to the small number obtained. Protein concentration in LAB of the 5µM group was higher than in the control and 25µM groups (P<0.04). GSH concentration decreased in LAB of the 5µM group compared to the control (P=0.04). SOD activity and MDA concentration did not differ between groups (P>0.13). The 100µM treatment was detrimental to embryonic development. The decrease in GSH given by 5µM could be due to its provision of cysteine for embryonic protein synthesis, an effect observed in the increased protein concentration in LAB. The use of 5µM AAL in VIC medium could be a good strategy to improve the quality of bovine embryos.
Keywords: embryo development, culture, bovines